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发表期刊：Nature Genetics
发表单位：柏林医学系统生物学研究所
影响因子：41.307
发表时间：2022.07.21
DOI号：
10.1038/s41588-022-01129-5
研究背景
成年哺乳动物的心脏损伤通常会导致永久性瘢痕 。 然而 ， 成年斑马鱼心脏损伤后能有效再生 ， 这使得斑马鱼成为研究心脏再生细胞和分子机制的理想模型 。 在模拟心肌梗塞的低温损伤后 ， 受伤的斑马鱼心脏会经历一个短暂的纤维化期 。 在此期间 ， 受损的心肌会通过去分化和增殖进行再生 ， 这与心肌梗死的某些方面相似 。 然而 ， 在以往的斑马鱼心脏再生研究中 ， 还没有系统的数据来确定再生细胞的状态和细胞类型的起源 ， 对再生生态位的细胞组成、潜在的信号传递和相互作用的认识仍不全面 。 目前对活化巨噬细胞和成纤维细胞的定义严重依赖于转基因 ， 可能受到观察偏差的影响 ， 从而低估斑马鱼心脏再生过程中细胞状态的复杂性 。
材料方法
单细胞RNA-seq ：
表1 实验样本一览表
空间转录组（Tomo-seq）：斑马鱼心房和心室一共100张切片 ， 每张切片分别做RNA-seq
方法：scRNA-seq、Tomo-seq、荧光原位杂交和基于CRISPR-Cas9技术的谱系追踪
研究结果
1. 再生心脏的细胞组成
为了系统地识别健康和再生斑马鱼心脏中的细胞类型 ， 作者对损伤前后不同阶段的大约20万个解离细胞进行了scRNA-seq（图1a） 。 为了准确得到细胞发育起源的相关信息 ， 作者还应用了一种基于CRISPR–Cas9技术的大规模平行谱系追踪方法 ， 通过注射Cas9和针对多拷贝转基因(斑马鱼系中的dTomato：一种用于斑马鱼细胞追踪和谱系分析的多光谱细胞标记)的sgRNA ， 创建了作为谱系条形码的“遗传疤痕”来记录早期发育中的谱系关系 。
作者首先评估了健康和再生心脏中的细胞类型多样性 ， 单细胞转录组的聚类分析显示了所有主要的心脏细胞类型 。 正如预期的那样 ， 观察到成纤维细胞和免疫细胞在损伤后强烈增加（图1b） 。 进一步检查聚类数据发现 ， 心脏的三个主要层:心外膜、心肌和心内膜的细胞类型之间存在一个亚结构 。 作者假设 ， 由于心房和心室中这些细胞类型的功能差别 ， 这种细胞类型的亚结构可能存在空间差异 。 于是使用Tomo-seq方法（一种用冷冻切片机沿感兴趣的轴对组织进行切片 ， 然后在每个切片上进行RNA-seq的技术）进行空间分辨率转录组 ， 并将空间数据解卷积为单细胞转录谱 ， 可以验证一些细胞亚型在心房和心室富集（图1c） 。 之后再通过物理分离心房和心室 ， 使用scRNA-seq证实了这一发现（图1d） 。
图1 再生心脏的细胞组成
2. 心脏成纤维细胞的细胞类型多样性
作者进一步确定了心肌细胞中的一个转录亚结构（图2a） 。 除了以表达ATP合成和三羧酸循环相关基因(atp5pd和aldoaa)为特征的成年心肌细胞外 ， 还检测到一个较小的与心肌细胞发育相关的基因簇(ttn.1 ttn.2 bves and synpo2lb) ， 以及nppa——此前已被证明是边界区去分化心肌细胞的标记基因 。 这些去分化心肌细胞是心脏再生的标志 ， 其数量在3 d.p.i.（受伤后天数）增加了(图2a) ， 并与已建立的标记基因nppa22部分共定位于7 d.p.i. 。
作者注意到心脏再生中三个成熟的信号因子在成纤维细胞中高度富集:合成视黄酸的酶aldh1a2、心肌细胞有丝分裂原nrg1和再生细胞外基质(ECM)因子fn1a（图2b） 。 为了更详细地研究心脏成纤维细胞的多样性 ， 作者对成纤维细胞进行了亚群聚类 。 结果显示出惊人的多样性 ， 有13个转录上不同的成纤维细胞聚类(图2c) 。 这13个基因簇在ECM相关基因的表达谱上表现出明显的差异（图2d） ， 但它们的转录组多样性远不止于此——去除ECM相关基因后 ， 可以高精度鉴定相同的成纤维细胞亚型 。
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