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美国科学院院报：生物源性非晶钙「ACC」——碳酸钙最易溶形式

基因 蛋白质 氨基酸 甲壳类动物


美国科学院院报：生物源性非晶钙「ACC」——碳酸钙最易溶形式


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研究·背景
甲壳类动物的生长需要定期脱落和更换外骨骼 。 在一些甲壳类动物中 ， 蜕皮发生在整个生命周期中 ， 而其他物种仅在达到性成熟之前蜕皮 。 提供支撑、刚性和保护的甲壳类动物外骨骼包含几丁质有机基质 ， 其中沉积了方解石或无定形碳酸钙 (ACC) 。
在一些甲壳类动物中 ， 例如淡水红爪螯虾Cherax quadricarinatus ， 钙主要来自饮食 ， 但也来自脱落前外骨骼的重吸收 ， 并以稳定的 ACC 形式储存在短暂的钙沉积物中 。
在小龙虾中 ， 这些沉积物由一对称为胃石的盘状结构组成。 胃石 ， 也在其他十足类动物中发现 ， 是在胃石盘柱状上皮和心脏胃壁之间的空腔中形成的细胞外结构 。 上皮用于将血淋巴钙输送到胃石沉积部位并参与胃石有机基质的合成 。
研究 · 内容
  • 使用 ACC（碳酸钙的最易溶形式）促进了钙从外骨骼到临时储存沉积物和返回的循环运输 。 在大多数甲壳类动物中 ， 外骨骼碳酸钙主要以稳定的结晶形式存在 ， 即方解石；然而 ， 在某些物种中 ， 它也可能以不太稳定的无定形形式沉积 。
  • 人们认为后者代表了大多数临时碳酸钙沉积物的主要形式 ， 例如小龙虾中的胃石或陆地等足纲中的胸骨沉积物 。
  • ACC 是存在的主要碳酸钙形式 ， 不仅存在于胃石中 ， 而且存在于外骨骼中 。 否则不稳定的 ACC 的稳定可能需要细胞外基质内特化大分子的介导 。
  • 外骨骼和瞬时储存器官中的细胞外有机基质由致密的几丁质-蛋白质微纤维构成 。 已经详细描述了与钙化过程相关的几种甲壳类动物外骨骼基质蛋白 。 尽管这些蛋白质的具体功能仍然知之甚少 ， 但建议它们在碳酸钙沉淀和结晶的抑制/调节中发挥作用 。
  • 甲壳类动物瞬时贮藏器官中碳酸钙沉淀的机制知之甚少 ， 目前仅鉴定出两种瞬时贮藏器官蛋白 ， 即 orchestin 和 GAMP 。 Orchestin 是一种钙结合蛋白 ， 从陆生甲壳动物Orchestia cavimana的钙储存器官的有机基质中分离出来 。
  • 体外实验表明 ， orchestin 与生长中的方解石晶体相互作用 ， 其钙结合能力被认为取决于丝氨酸磷酸化 。 胃石基质蛋白 (GAMP) ， 首先从小龙虾的胃石中分离出来 ， Procambarus clarkii ， 被认为是抑制碳酸钙沉淀的几丁质结合蛋白 。 GAMP 的免疫定位显示其存在于胃石生长的所有阶段和外骨骼的某些层 。
  • 尽管在蜕皮前诱导了 orchestin 和 GAMP 表达 ， 但由于缺乏关于它们在体内作用的证据 ， 对这些钙化相关蛋白的详细研究受到了阻碍 。 诸如基因沉默之类的分子干预技术可能对纠正这种情况很有用 。
  • 迄今为止 ， 在甲壳类动物中使用 RNAi 受到限制 ， 主要目的是干扰病毒相关或神经肽编码基因的表达 。 直到现在还没有尝试过沉默与生物矿化相关的内源基因 。
在这项研究中 ， 我们已经从小龙虾C. quadricarinatus的胃石基质中鉴定并表征了一种蛋白质 。 使用体内基因沉默和体外碳酸钙沉淀测试了这种蛋白质在胃石和细胞外基质形成中的双重作用 ， 以及其在稳定 ACC 中的生物矿化功能 。
研究 · 结果EGTA 提取的胃石蛋白的 SDS/PAGE 分离显示存在至少六种不同的突出蛋白质（图1A） ， 其中 ≈65-kDa 的种类 ， 称为 GAP 65（胃石蛋白 65）是最丰富的 。
通过 SDS/PAGE 分离富含 GAP 65 的 HPLC 级分 ， 并用考马斯亮蓝、“全部染色”（对于带负电荷的蛋白质）或高碘酸-希夫试剂 (PAS)（对于糖蛋白）进行检测（图 1B ） ， 表明 GAP 65 是带负电荷的糖蛋白 。
图1


Isolation of gastrolith proteins and purification of GAP 65. (A) Coomassie staining of the SDS/PAGE-generated protein profile of the gastrolith extract (GE) is shown on the right. Molecular mass markers (kDa) are shown on the left. (B) Pooled GAP 65-containing fractions collected at 1 M NaCl were purified by DEAE chromatography separated by SDS/PAGE and stained by Coomassie blue (left lane) “Stains all” (center lane) or Pas (right lane).

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