Worthington核糖核酸测定详细攻略 _卵巢癌

艾美捷Worthington核糖核酸背景：
核糖核酸是通过 3'5'-磷酸二酯键连接的核苷酸的长链聚合物。组成碱基是嘌呤和嘧啶的衍生物，糖是D-核糖。 RNA核苷酸序列是从DNA传递的遗传信息，在蛋白质合成中作为氨基酸测序的模板。参见JD Watson的基因分子生物学第3版（WA Benjamin Inc. Menlo Park California 1975）中的第11章- DNA模板上的RNA转录和第12章- RNA参与蛋白质合成。核糖核酸核心由酵母核酸钠彻底核糖核酸酶水解后剩余的有限多核苷酸组成。
艾美捷Worthington核糖核酸化学结构：
【Worthington核糖核酸测定详细攻略】
艾美捷Worthington核糖核酸测定：
Method :通过在RNase测定中用作底物来确定作为RNase底物的适用性。由于反应发生的速率不同以及从生物来源分离的RNA中核苷酸模式的显着差异，核糖核酸酶活性的标准化一直很困难。克鲁克等人。 (1960)发表了使用合成底物2' 3'-磷酸胞苷的测定。 Zimmerman和Sandeen (1965)描述了一种使用聚胞苷酸的灵敏测定。
Kalnitsky等人的方法。（1959）在沃辛顿使用。酵母RNA在pH 5.0的水解速率是通过测量在规定条件下释放的酸溶性寡核苷酸的量来确定的。在指定条件下，一个单位会导致A260在37°C和pH 5.0下的吸光度增加1.0 。
试剂：
0.10 M醋酸钠缓冲液， pH 5.0：将5.75 ml冰醋酸溶解在900 ml试剂级水中。用5 N NaOH将pH值调节至5.0 ，并用试剂级水使最终体积达到1000 ml 。
含有 0.75%乙酸双氧铀的25%高氯酸：将50 ml 70%高氯酸(HClO 4 )溶解在90 ml试剂级水中。添加750 mg乙酸双氧铀(MW 424.15)并搅拌溶解。
RNA溶液：将100 mg Worthington核糖核酸(RNA)溶解在10 ml 0.1 M醋酸钠缓冲液中， pH 5.0轻轻搅拌以溶解以防止变性。在0.10M醋酸钠pH 5.0中以1:50稀释度记录A260 ，以确定mg RNA/ml 。 mg RNA/ml = A260 x稀释度x 0.04
在 0.10M醋酸钠中稀释至2.5 mg/ml RNA ， pH 5.0用于测定。测定前在37°C下孵育5-10分钟。准备一份待测RNA溶液，以及另一份不同批次RNA的溶液用作对照。
RNAse：
在试剂级水中制备 1 mg/ml的储备溶液。
在即将进行测定之前，在 0.10 M醋酸钠， pH 5.0中进一步稀释至每毫升2、4和6微克。
程序：
确定 % Native RNA：将10 mg RNA溶解在10 ml 0.015% NaCl中。在NaCl中按1:50稀释，将3 ml移液器移入比色杯中，在260 nm和320 nm处读数。加入0.2 ml 5N NaOH（新鲜，储存在塑料中）。在260和320 nm处读取。在37°C下静置一小时。在260和320 nm处读取。确定% Native：（如果低于60% ，请联系主管。）。
A320是对无关背景的检查。
RNase Blank Assay：（可通过RNase检测设置）为样品RNA设置空白，为测试RNA设置空白。将1 ml 0.10M醋酸钠缓冲液pH 5.0移入离心管中。平衡至37°C 。加入一毫升RNA溶液（2.5毫克/毫升）。让我们在37°C设置一小时。然后加入一毫升乙酸双氧铀-高氯酸溶液。转移到冰浴中冷却5分钟。离心澄清并用试剂级水将0.1ml澄清上清液稀释至3.0ml 。阅读A260与空白。在37°C下，空白在一小时内不应增加超过50% 。
RNase Assay：为样品设置一组试管，为对照设置一组试管。包括带有样品管组的空白和带有对照管组的空白。移取一毫升相应的酶稀释液到离心管中；吸取1 ml 0.10M醋酸钠缓冲液pH 5.0到空白管中。将所有试管在37°C下孵育58分钟。每隔一段时间，将1 ml RNA溶液(2.5 mg/ml)添加到所有试管（样品、对照和空白）中。将每管准确孵育4分钟，加入1 ml乙酸双氧铀-高氯酸溶液终止反应。转移到冰浴中冷却5分钟。离心澄清并用试剂级水将0.1 ml澄清的上清液稀释至3.0 ml 。阅读A260与空白。
计算
单位/mg dw = (A260 -空白) x 30 x稀释x标准化因子
注意：由于用作底物的 RNA来源于天然来源，因此会出现批次间差异。为了克服这一点，运行核糖核酸酶标准并将值调整为标准。示例：如果分配给标准的值为2500 u/mg ，而获得的标准值为2000 u/mg ，则将1.25的系数应用于化验值。
Worthington核心酶：包括：胶原蛋白酶，脱氧核糖核酸酶I ，弹性蛋白酶，木瓜蛋白酶，核糖核酸酶，胰蛋白酶等。

Worthington核糖核酸测定详细攻略

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