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医学分子生物学-整理笔记( 四 )

核糖核酸 生物学 蛋白质 染色体


CDNA文库:将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA ， 各cDNA分别插入载体形成重组子 ， 再导入宿主细胞克隆扩增 。 这些重组子内的cDNA的集合即cDNA文库 。
DNA连接酶及其在基因工程中的主要用途
DNA连接酶是能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’磷酸基团末端之间通过形成磷酸二脂键 ， 使两末端连接的一种核酸酶 。它能连接目的基因和载体从而构成重组子 。
DNA聚合酶I在基因工程中的主要用途
1.  5’—3’DNA聚合酶活性 。 2.  5’—3’外切酶活性 。 3. 3’—5’外切酶活性
基因突变的概念 ， 类型及其遗传性效应
基因突变：在基因的特定DNA序列中 ， 其碱基组成及排列顺序可因机体内外因素的作用发生改变 ， 导致DNA一级结构发生改变 ， 改变基因结构 ， 形成基因突变 。 包括:点突变 ， 缺失 ， 插入 ， 倒位 ， 配子突变和体细胞突变 ， 动态突变 。
其遗传性效应：1.基因突变引起遗传密码的改变（错义突变 ， 无义突变 ， 同义突变 ， 移码突变）2.基因突变影响hnRNA的剪切 。
功能克隆及定位克隆的概念
功能克隆：利用蛋白质的表达及功能信息分离未知基因的方法叫未知基因的功能克隆 。
定位克隆：利用基因在染色体的位置信息分离鉴定未知基因的策略 。
基因结构和表达与疾病的研究策略
1.通过结构分析确定基因变异在疾病发生中的作用 。 2.通过基因表达水平分析确定基因在疾病发生中的作用 。 3.通过功能学研究确定基因在疾病中的作用 。
功能克隆及定位克隆的方法
功能克隆：1.通过纯化蛋白质的氨基酸序列信息分离鉴定未知基因 。 2.通过蛋白质的抗原抗体反应分离鉴定未知基因 。 3.通过mRNA的差异分离鉴定未知基因 。
定位克隆1.用遗传分析和染色体断裂点分析对疾病基因定位2.利用HGP数据进行靶区域的基因组分析3.通过编码序列筛选鉴定基因4.采用突变分析技术筛选致病突变
基因诊断的基本技术：核酸分子杂交和PCR扩增
基因诊断：利用分子生物学技术 ， 从DNA/RNA水平检测基因的存在 ， 分析基因的结构变异和表达状态 ， 从而对疾病作出诊断 。
Southern印迹：用于DNA的检测 ， 不但能检测出特异的DNA片段 ， 还能进行定位和测定分子量 ， 可用于基因的限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等 。
Northern印迹:杂交用于RNA的检测 ， 能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析
斑点杂交:既可检测DNA也可检测RNA ， 用于基因组中特定基因及其表达的定性和定量分析 ， 方法简单、快速、灵敏、样品用量少；缺点是不能鉴定所分析基因的分子量 ， 特异性较低、有一定比例的假阳性 。
原位杂交：是细胞学技术与核酸杂交结合的一种核酸分析检测技术 。 用标记核酸探针与细胞涂片、压片、细胞悬液滴片或组织切片上具有互补序列的单链DNA或RNA进行杂交 ， 然后通过放射自显影或酶底物显色或激发荧光等方法检测待测核酸分子 。
限制性片断长度多态性：基因突变导致的基因碱基组成或（和）顺序发生改变 ， 会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的限制性内切酶位点消失 。 因此 ， 突变基因在经过相应的限制性内切酶水解后 ， 其电泳条带的数量和大小就会发生改变 ， 根据这些改变可以判断出突变是否存大 。
对不同的疾病需要采用不同的基因诊断策略：对致病基因已经找到、发生机制也基因清楚的疾病 ， 可以通过直接检测致病基因进行基因诊断；对致病基因还没有找到、发生机制不清 ， 但致病基因已经定位于染色体或基因组的特定区域的疾病 ， 可以通过检测致病基因的连锁遗传标记进行基因诊断；对过些多因素、多基因疾病 ， 则要通过检测表型克隆基因进行基因诊断；还有的疾病可能并没有基因结构的变异 ， 但由于受内外环境因素影响 ， 其表达发生了改变 ， 导致相应蛋白质过多或过少而引起的疾病 ， 就需要通过基因表达的定量分析进行基因诊断 。
通过致病基因的检测诊断疾病
通过连锁遗传标志检测诊断疾病
通过表型克隆建立疾病基因诊断指标
通过基因表达的定量分析诊断疾病
遗传标记的选择一般遵守的两条基本原则：1、多标记原则（要求选择多个与致病基因连锁的遗传标记 ， 这样可以增加信息量 ， 提高间接基因诊断结果的可靠性）2、近距离原则（要求首选位于基因内的遗传标记 ， 基因外遗传标记由于离致病基因较远 ， 有可能发生基因重组而影响判断的可靠性）

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