Cell 子刊：CHD8单倍不足影响兴奋性和抑制性神经元发育轨迹 _神经元

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【Cell 子刊：CHD8单倍不足影响兴奋性和抑制性神经元发育轨迹】本文由brainnews脑科学世界团队原创编译，转载请联系授权。
染色体域解旋酶DNA结合蛋白8(CHD8)基因突变是导致自闭症谱系障碍(ASD)的一个重要的危险因素，但CHD8单倍不足如何影响神经发育仍然未知。
2022年4月5日CN研究团队在Cell Reports杂志发表文章，题为CHD8 haploinsufficiency alters developmental trajectories of human excitatory and inhibitory neurons linking autism文章报道，在人脑中， CHD8单倍不足扰乱了神经发育轨迹，分别加速和延迟了抑制性和兴奋性神经元的产生，在第60天和第120天，成比例对称相反的扩增，这种失衡可能与ASD患者的大头畸形相关。
研究人员通过患者特异性突变和马赛克类器官的等位基因设计，定义了基因型-表型关系，并解释了他们的细胞自主性。研究结果表明，细胞类型特异性CHD8依赖的分子缺陷，与异常的增殖和选择性剪接程序有关。

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1. CHD8杂合突变导致脑类器官大小增加

图一：CHD8杂合突变导致的脑器官大小增加
在优化了前人hESC的培养条件之后，研究人员发现，随着时间的进展，类器官的大小随之增加， mRNA表达水平检测发现， CHD8表达水平最高，这表明CHD8可能在此发育阶段发挥重要作用。
接下来，研究人员在基于转录组学的疾病建模基准的基础上，采用等基因实验设计，利用簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因组工程技术在hESC系等基因中引入CHD8突变。培育了两个独立的hESC株(CHD8+/-和CHD8+/-；GFP)和两个携带导致密码子提前终止的患者特异性突变的细胞系（S62X和E1114X）。其中， S62X患者虽出现ASD核心症状，但无头颅畸形和智力残疾。
研究人员将CHD8突变与eGFP荧光蛋白表达偶联，即CHD8+/-；GFP ， CHD8+/E1114X；GFP ， CHD8+/S62X；GFP ，将这些携带选定CHD8突变的人胚胎干细胞分离、扩增，并分析潜在的靶外效应，通过免疫印迹和qPCR检测突变对CHD8蛋白和mRNA水平的影响。结果证实，所有突变体均表现出CHD8蛋白和mRNA表达水平降低。

图二：大脑类器官再现了神经源性谱系
2. 大脑类器官能够再现神经源性谱系
为了明确CHD8单倍不足的细胞机制，研究人员应用单细胞RNA-seq（scRNA-seq）对20天、60天、120天这三个不同发育阶段进行测序。并结合已知细胞标记应用Leiden算法，将其按照时间关系及细胞群体演化分为10个细胞群，其中包括放射状胶质细胞簇、兴奋神经元、中间神经元及少量未知细胞。
通过树图分析，研究人员发现，与对照组相比，尽管大脑类器官在神经前体细胞阶段，兴奋性和抑制性谱系通过这种方法没有被分解为单独的种群，但这些谱系在它们的分化过程中表现出从祖细胞到神经元的典型的拟时间进程且每个神经元群体在整个阶段丰度的增加都与预期相匹配。

图三：CHD8单倍不足导致细胞数量比例的一过性异常和神经元间的早熟分化
3. CHD8单倍不足导致细胞数量比例的一过性异常和神经元间的早熟分化
为了明确CHD8单倍不足对皮质发育的影响，研究人员重点研究了3个CHD8的突变株， CHD8+/-CHD8+/-;GFP和CHD8+/E1114X ，它们的表型与大脑类器官过度生长导致的巨头畸形一致。通过拟时间跟踪发育的分支，研究人员发现，突变细胞株第60天的中间神经元分支和第120天的兴奋神经元分支表达丰度较高。
研究人员分别计算了突变组和对照组在每个阶段的前三个拟时间成分，从而分析每个阶段最相似的三个拟时间成分。该分析显示，在对照组中，前两个最有可能的轨迹提示产生两个不同的兴奋性神经元簇，而在突变组中，第二个最有可能的轨迹预测中间神经元的产生，这证实了CHD8单倍不足能够加速中间神经元的发育，从而在第60天产生更高比例的中间神经元。

Cell 子刊：CHD8单倍不足影响兴奋性和抑制性神经元发育轨迹

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