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不啰嗦 , 直接干货:
- 样本前处理
b.细胞样本:吸干培养基上去 , 按1mL trizol/10cm2培养皿的比例加入trizol , 并用移液枪吹打数次直至细胞被完全裂解下来 。
2.室温静置5min , 让RNA可以充分释放 。
3.按 1 mL Trizol 加入 200 μL 氯仿 , 盖好管盖(注意:此次一定要盖好盖子 , 避免震荡过程中液体渗出) 。 用手剧烈震荡 15 s , 室温放置 3 min;
4.12000 g、4℃离心 15 min;(离心后样本会分三层 , 最上层是透明的水相 , RNA溶在水相中)
5.小心转移上清液(约500 μL)至新的 1.5 mL 无酶离心管中;
6.加入等体积异丙醇 , 室温静置10min;(若预期RNA量比较少 , 可加入适量糖原 , 并于-20℃或-80℃沉淀 过夜;)
7.12000 g、4℃离心 10min;弃掉上清 , 保留沉淀;
8.加入 1 mL 75%乙醇 , 涡旋或颠倒混匀;
9.7500 g、4℃离心 5 min;弃掉上清 。
【RNA 提取步骤(trizol)】10.7500 g、4℃离心 30s;用10ul小枪头尽量吸掉残留的液体 。
11.室温静置5~10min , 晾干乙醇 。 (看到RNA变半透明即可)
12.加入适量RNase-free水溶解RNA室温静置10min;令RNA可以充分溶解 。
13.分装少量RNA , 剩余RNA冻存到-80℃冰箱备用 。
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