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诱导|知识分享：IPTG诱导蛋白表达的实验方法

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诱导|知识分享：IPTG诱导蛋白表达的实验方法
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实验原理：
E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因 ， 分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶 ， 此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因I 。 I基因编码一种阻遏蛋白 ， 后者与O序列结合 ， 使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态 。 在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激 活蛋白（CAP）结合位点 。 由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区 ， 三个酶的编码基因即由同一调控区调节 ， 实现基因产物的协调表达 。
在没有乳糖存在时 ， lac操纵子（元）处于阻遏状态 。 此时 ， I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合 ， 阻碍RNA聚合酶与P序列结 合 ， 抑制转录起动 。 当有乳糖存在时 ， lac操纵子（元）即可被诱导 。 在这个操纵子（元）体系中 ， 真正的诱导剂并非乳糖本身 。 乳糖进入细胞 ， 经β-半乳糖苷酶催化 ， 转变为异乳糖 。 后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白 ， 使蛋白构象变化 ， 导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录 。 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同 ， 是一种作用极强的诱导剂 ， 不被细菌代谢而十分稳定 ， 因此被实验室广泛应用 。

诱导|知识分享：IPTG诱导蛋白表达的实验方法
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实验试剂：
1、LB（Luria-Bertani）培养基：酵母膏(Yeast extract)5g 、蛋白胨(Peptone) 10g 、NaCl 10g 、琼脂(Agar) 1-2% 、蒸馏水(Distilled water) 1000ml 、pH 7.0 。
2、IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中 ， 0 . 22 μm 滤膜过滤除菌 ， 分装成1 mL /份 ， -20 ℃ 保存 。
3、凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 、50 mmol / L DTT、 2 % SDS （电泳级）、 0.1 ％ 溴酚蓝 、10 ％ 甘油 。
【诱导|知识分享：IPTG诱导蛋白表达的实验方法】实验步骤：
1、用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因；
2、按连接步骤连接目的基因和载体 ， 并转化到转化DH5α感受态细胞中；
3、分别挑取单菌落接种于5 mL LB ( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中 ， 37℃培养过夜；
4、以2 %体积比转接于2 ml LB( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中 ， 37℃继续培养2.5 hr ， 至细菌对数生长期 ， 加0.1 mmol/L IPTG 2 μl诱导3-4 hr ， 同时设立不加IPTG诱导作为对照；
5、取上述菌液1 mL ， 12000 rpm离心10min ， 收菌沉淀；
6、重悬于冰的100 μl PBS中 ， 加入PMSF至终浓度为10 mmol/L 。 震荡器震荡混匀 ， 加入2×加样缓冲液 ， 煮沸10 min变性 ， 12,000 rpm离心10 min；
7、分别取诱导前和诱导后的样品10 μl进行SDS-PAGE电泳分析 。
（PS：如果表达载体的原核启动子为PL 启动子 ， 则在30 -32 ℃培养数小时 ， 使培养液的OD600达0.4-0.6 ， 迅速使温度升至42 ℃继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等 ， 则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L ， 继续培养3 -5h）

诱导|知识分享：IPTG诱导蛋白表达的实验方法
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