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溶液|知识分享：WesternBlot实验方法及注意事项

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溶液|知识分享：WesternBlot实验方法及注意事项
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实验原理：
WesternBlot印迹方法 ， 又称为免疫印记 ， 是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ， 对不同分子量的蛋白质进行分离 ， 并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上 ， 用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合 ， 再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合 ， 最后用ECL超敏发光液试剂检测 。 如果转印膜上含有靶蛋白 ， 经X光片曝光、显影后 ， 则会在X-光片上出现特异性蛋白条带 。
实验材料：
分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris?Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物 、1×SDS电泳缓冲液 、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件 、0.75mm封边垫片 、0.75mm样品梳子 、50μl微量加样器、恒流电源
常用试剂：
1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺
将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml水中 ， 加热至37℃溶解之 ， 补加水至终体积为100ml 。 0.45μm微孔滤膜过滤除菌 ， 查证该溶液pH应不大于7.0 ， 置棕色瓶中保存 。
小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收 ， 其作用具有累积性 。 称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具 。 可认为聚丙烯酰胺无毒 ， 但也应谨慎操作 ， 因为它还可能含有少量未聚合材料 。
2）4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,
在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L) ， 用1mol/L调节pH至8.8,补加H2O至体积500ml 。 用0.45μm滤膜过滤溶液 ， 再加入2g SDS[0.4%(w/v)] ， 于4℃可保存1月 。
3）4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,
在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L) ， 用1mol/L调节pH至6.8,补加H2O至体积100ml 。 用0.45μm滤膜过滤溶液 ， 再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)] ， 于4℃可保存1月 。
4）4×SDS电泳缓冲液
Tris base 24.2 g 、Glycerin 115.3 g 、20%SDS 20 ml
加水至总体积1000ml 。
应用时稀释4倍即为1×SDS电泳缓冲液(Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%) 。
【溶液|知识分享：WesternBlot实验方法及注意事项】5）TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合 。
6）10%过硫酸铵
过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需癿自由基 。 可用去离子水配制小量10%(w/v)癿贮存液并保存于4℃ 。 由于过硫酸铵会缓慢分解 ， 故应隔周新鲜配制 。
实验步骤：
转染后的样品 ， 收毒 ， 12000rpm离心 ， 2min ， 去上清 ， 细胞碎片就直接进行下面步骤：
（1）加入10 x RIPA buffer/每孔200μl ， 4°裂解30min 。
（2）准备热变性 ， 用八连管 ， 每孔加入5 x loading buffer 5μl 。
（3）用20μl移液枪 ， 将裂解后的细胞取出20μl,加入对应的八连管中 ， 并吹打混匀 。
（4）封口 ， 用PCR仪进行热变性处理：97°8min 。
（5）4°储存变性后的样品 ， 待检 。
1、SDS-PAGE凝胶的配制
预先配制混合液（Tris-HCL/Acr-bis/SDS/H2O）,APS以及TEMED在配制凝胶时现加 。
分离胶：用1.5M Tris-HCL 8.8、10%分离胶 。 （所谓的10%浓度为Acr-Bis的浓度 ， 即丙烯酰胺的浓度 ， 用水定容 ， 其他成分不变）；浓缩胶：用1M Tirs-HCL 6.8、浓度：5% 。
2、上样电泳：
所用梳子为15孔 ， Marker占用一孔 ， 故每块凝胶可以检测14支样品 。 上样量：Marker：5 μl/孔； 样品：20μl/孔；参数：80V ， 待样品跑出上样孔；120V ， 样品进入分离胶；200V ， 直至结束（蓝色指示带到凝胶底部即完成电泳）
3、转膜：
转膜三明治结构顺序：黑色板、网垫、一层滤纸、凝胶（习惯将Marker放在右侧）、NC膜（在膜的蛋白面左上角做好标记）、两层滤纸、网垫、白色板 。
备注：所用的滤纸也分粗糙面和细腻面 ， 细腻面对着凝胶和NC膜 ， 粗糙面对着网垫 。 将三明治结构的夹子放入电极时 ， 黑色板对应电极的黑色一面（负极）、白色版对应电极的红色一面（正极） 。
强调：凝胶和NC膜（硝化纤维素膜）的顺序千万不要放反 ， 所用的NC膜分粗糙面和光滑面 ， 粗糙面为接受蛋白面 ， 该面和凝胶直接接触 。 盖槽盖时 ， 同样注意黑色对应黑色、红色对应红色；同样导线电极连接电源的时候 ， 也是黑色对黑色、红色对红色 。 上述任何一步弄反 ， 都会导致蛋白转膜失败 ， 切记 。
转膜所用参数：稳流45mA ， 过夜（999min） 。
4、封闭
所用封闭液：5% Nonfat milk ， 用TBST配制 ， RT（室温） ， 30min~1h（根据实际情况确定时间 ， 比如封闭液已使用次数、ECL显色的背景） 。 为了防止奶粉变质 ， 加入叠氮钠即NaN3（一种光谱的防腐剂） ， 终浓度为0.02%（本实验室叠氮钠储存液浓度为2%）
洗：TBST ， 洗去残余的奶粉 。
5、一抗孵育
所用抗体：mouse ， Anti-Flag 。
一抗稀释：4%BSA by Super Block ， 1:1000 。 亦加入0.02%的叠氮钠NaN3 。
孵育：RT ， 约3h 。
洗：TBST ， 3 x 5min
6、二抗孵育
所用抗体：HRP ， anti-mouse 。
二抗稀释：5%Nonfat milk by TBST ， 1:2000.（二抗一般用两次或三次就更新）（强调：二抗中不可以加NaN3 ， ,因为其会抑制HRP的活性）
孵育：RT ， 1h 。
洗：TBST ， 6 x 5min 。
7、显色：ECL 。
A液/B液 ， 各取300μl等体积混合 ， 现用现配 。 用荧光笔标记好NC膜上的Marker以及上样孔的位置 。 将反应液均匀的加到膜上（蛋白面） ， 浸湿整张膜 ， 然后轻轻的将膜的蛋白面向下放入显色仪 ， 盖上盖子 ， 点击开始 。

溶液|知识分享：WesternBlot实验方法及注意事项
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注意事项
1、开始配胶的板子一定得夹紧 ， 防止漏胶 。
2、上样的板子也得夹紧 ， 防止漏电缓液 ， 在跑胶出现胶的快慢不一样 ， 原因上样前两块胶的板子没有加紧漏电缓液 ， 还有就是胶的浓度不一样 。
3、上样时 ， marker5ul加5 x loading buffer混匀一起上样 ， 这样可以防止在跑电泳的过程 ， 样品把marker给挤的越来越窄 。
4、转膜时 ， NC膜的正面左上角先用marker笔做好标记 ， 防止后面孵育抗体与显色的过程分不清NC膜的正反面 。
5、转膜之前 ， 先把NC膜放在转膜液浸泡 ， 注意从一端慢慢的往下浸泡 ， 否者NC膜容易泡不透 ， 影响转膜 。
6、显色时 ， 往NC膜上加转膜液也得从一边慢慢往下加 ， 否者最后显色效果也不好 。
7、转膜时 ， NC膜与胶的接触之前千万不可有气泡 ， 否者对结果的目的条带有影响 。
常见问题
1、胶片是一片空白 ， 是怎么回事？如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上 。 1）二抗的HRP 活性太强 ， 将底物消耗光；2）ECL底物中H2O2不稳定 ， 失活；3） ECL底物没覆盖到相应位置；4）一抗选择不当；5）二抗失活 。 2、背景高咋回事？膜没有完全均匀湿透,建议 使用100% methanol浸透膜；洗膜不充分 ， 可以增加洗液体积和洗涤次数；电极不平衡或者加样位置偏斜 ， 可以调整电极和加样；封闭物用量不足 ， 可以提高封闭物浓度 ， 孵育时保证封闭液完全浸没转印膜；封闭物使用不当 ， 比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭；封闭时间不够 ， 一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜；7）抗体非特异性结合 ， 可以降低抗体浓度 ， 减少孵育时间8）一抗稀释度不适宜 ， 可以对抗体进行滴度测试 ， 选择最适宜的抗体稀释度9）一抗孵育的温度偏高 ， 建议4℃结合过夜10）抗体浓度过高或洗涤不够 ， 建议降低抗体浓度 ， 增加洗涤次数和时间11）化学显色底物过多 ， 建议按说明书加入适量的显色底物3、为啥条带形状不好看？1）胶凝的不均匀或聚合不好 ， 建议灌胶前将溶液充分混匀2）某些样品盐浓度较高 ， 建议除盐或将样品盐浓度调成一致3) 缓冲液陈旧 ， 成分改变,可以重配4) 凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走5）电泳时温度过高 ， 可以降低电流或电压6）样品中含有不溶性颗粒 ， 建议样品充分搅拌混匀4、蛋白条带位置（大小）不对咋整？胶浓度不对 ， 不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差 ， 可以调整浓度抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度 ， 延长孵育时间3）酶失活 ， 建议直接将酶和底物进行混合 ， 如果不显色则说明酶失活了 。 选择在有效期内、有活性的酶联物4）目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体 ， 建议查询相关文献确定5）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 ， 建议设置阳性对照比对结果 ， 增加标本上样量5、有很多杂带咋回事？1）目的蛋白有多个修饰位点 ， 本身可以呈现多条带 ， 建议查阅文献或进行生物信息学分析 ， 获得蛋白序列的修饰位点信息 ， 通过去修饰确定蛋白实际大小2) 样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作3）杂蛋白多 ， 建议处理目的蛋白4）抗体特异性不强 ， 建议使用特异性强的抗体5）抗体孵育时间过久 ， 建议减少抗体孵育时间6）二抗与抗原有交叉反应 ， 建议选择合适的封闭物7）二聚体或多聚体存在 ， 建议增加蛋白质变性过程及强度8）底物显色与曝光时间过长 ， 建议缩短显色及曝光的时间6、背景有黑色斑点或有不均匀的白色斑点以及暗背景上白色带1）抗体与封闭试剂反应 ， 建议使用前过滤封闭试剂2）HRP含量过高 ， 建议降低酶联二抗的浓度3）HRP偶联二抗中有聚集体 ， 建议过滤二抗试剂 ， 去除聚集体4）抗体分布不均匀 ， 建议孵育抗体时使用摇床7、细胞水平要做WB ， 多少细胞提的蛋白够做WB？答：一般5×10^6就足够 。 8、为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？可能的原因有：1）细胞中不表达这种蛋白质 ， 换一种细胞；2）抗体不能识别目标蛋白 ， 多看看说明 ， 是否有问题；3）可能是没有保持低温操作 ， 样品保存不当 ， 样品放置时间过长；4）细胞中的蛋白质被酶降解掉了 ， 可加入蛋白酶抑制剂 ， 抑制蛋白酶活性 。 9、我的目的带很弱 ， 如何加强？1）可以加大抗原上样量 ， 这是最主要的；2）也可以将一抗稀释比例降低；3）还可以延长曝光时间 。 10、我做的蛋白质分子量很小（10KD） ， 请问怎么做WB？1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜 ， 转膜时间缩短 ， 另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；2）也可以选择PSQ 膜 ， 同时缩短转移时间 。 也可以将两张膜叠在一起 ， 再转移 。 其他按步骤即可 。 11、大分子量蛋白200KD ， 在做WB要注意什么？1）做200kd蛋白的WB时要注意 ， 分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）；3）转膜液中甲醇含量可适当降低 ， 推荐使用湿装转膜效率更高哦!12、如果上样量超载 ， 要用什么方法来增加上样量？可以浓缩样品 ， 也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白 。 一般地 ， 超载30％是不会有问题的 。 如果已经超了不少了 ， 而且小分子量的也要 ， 可以考虑加大胶的厚度 ， 可以试试1.5mm的 。 13、WB中抗体的可以重复应用吗？抗体工作溶液一般不主张储存反复使用 ， 但是如抗体比较珍贵 ， 可反复使用2－3次 。 稀释后应在2－3天内使用 ， 4度保存 ， 避免反复冻融 。 14、上下槽缓冲液有何要求 ， 怎样才能达到最佳效果？无特殊要求 。 但一般是上槽放新鲜的缓冲液 ， 下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液 。 15、免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位） ， 有些表位是线性的 ， 而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响 ， 天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制 ， 煮后变性会消失 。 如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸 ， 也就是线性表位 ， 那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB ， 而如果抗体识别构象形表位 ， 则只能用于免疫组化 。

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