一．Cre-loxP重组系统作用原理
1. Cre重组酶和loxP位点
Cre重组酶（Cyclization Recombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码 ， 是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质 。 它不仅具有催化活性 ， 而且与限制酶相似 ， 能够特异性识别loxP位点 。
LoxP（locus of X-overP1）位点长为34bp ， 包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域 。 其中 ， 反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点 ， 而间隔区域决定了loxP位点的方向 。
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图1. Cre重组酶和loxP位点
（http://2012.igem.org/Team:Tsinghua-A/Project/Design）
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2. Cre-loxP重组系统诱导基因重组的方式
Cre-loxP系统存在几种诱导重组的方式 ， 这是基于Cre重组酶与loxP位点的相互作用而实现的 。
当基因组内存在loxP位点时 ， 一旦有Cre重组酶 ， 便会结合到loxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体 。 此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合 ， 进而形成四聚体 。 随后 ， loxP位点之间的DNA被Cre重组酶切下 ， 切口在DNA连接酶的作用下重新连接 。 重组的结果取决于loxP位点的位置和方向 。 主要存在几下几种重组方式：
（1） 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同 ， Cre重组酶敲除loxP间的序列；
（2） 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反 ， Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转；
（3） 两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上 ， Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位；
（4） 四个loxP位点分别位于两条DNA链或染色体上 ， Cre重组酶诱导loxP间的序列互换 。
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图2. Cre-loxP诱导基因重组的方式
（https://www.tumblr.com/search/rolling%20circle%20replication）
二．Cre-loxP重组系统的优势
之所以Cre-loxP重组系统在转基因动物方面得到广泛的应用 ， 因其具有非常明显的优势 。 主要体现在：时空特异、高效性、准确性、快速性 。
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图3. Cre-loxP重组系统的优势
三．Cre-loxP重组系统在转基因中的应用
由于Cre-loxP重组系统的高效简单的作用方式 ， 它已在基因定点删除、外源基因定点整合、疾病动物模型建立、筛选高效表达基因座等方面得到了有效利用 ， 成为体内外DNA重组的有力工具 。
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图4. Cre-loxP重组系统在转基因中的应用
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四．病毒依赖的基因重组的优势
应用Cre-loxP重组系统较为常见的形式是两种转基因动物的杂交 。 一般的策略为：
（1） 利用原核注射的方法获得转基因“Cre小鼠” 。 一般利用特定启动子控制此小鼠的Cre重组酶的表达；
（2） 通过置换型载体的同源重组 ， 在胚胎干细胞中向靶位点引入选择标记基因 ， 并在其两侧引入两个loxP位点 ， 要求两条同源染色体都带有loxP位点 ， 且不能干扰靶基因的转录 。 将此胚胎干细胞注入假孕母鼠中 ， 发育成“floxed小鼠”；
（3） “Cre小鼠”与“floxed小鼠”交配 ， 产生的后代体内 ， Cre重组酶会与loxP位点发生作用 ， 导致基因重组 。
虽然此法具备了Cre-loxP重组系统的高效、特异的重组 ， 但存在许多不足：
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目前 ， 由于病毒依赖的基因重组能否克服转基因的动物的诸多不足 ， 从而成为越来越多科研工作者的新选择 。 病毒依赖的Cre-loxP重组系统的策略为：
（1） 通过转基因动物办法获得一只“Cre小鼠”或“floxed小鼠”；
（2） 病毒注射此“Cre小鼠”或“floxed小鼠” ， 引入loxP或Cre重组酶元件 。
此方法优势明显：
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五．维真生物为您提供Cre-loxP重组系统的AAV载体构建和病毒包装服务
1. 依赖Cre重组酶诱导表达的FLEX-ON系统
结合组织特异性的启动子和不同的AAV血清型 ， 维真生物提供的FLEX-ON系统能帮您获得更精准的组织特异性控制和时间控制 。
在FLEX-ON系统中 ， 目的基因反方向位于启动子下方 ， 两侧分别连接两个“头对头”的loxP 。 Cre重组酶不存在时 ， 目的基因不能表达；当Cre重组酶存在时 ， 可以诱导目的基因的“翻转” ， 从而表达 。
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图5. 维真生物提供依赖Cre的FLEX-ON系统示意图（左）维真生物的FLEX-ON实验图（右）
2. 依赖Cre重组酶反式剪接系统——轻松拥有“表达大基因的AAV”
较小的包装能力（小于5kb）使得AAV应用受到限制 。 维真生物为您提供依赖Cre的反式剪接系统 ， 让您轻松拥有“表达大基因的AAV” 。
多个重组AAV的共转染效率高达90% ， 维真生物将较大基因分为两部分构建于两个AAV载体上 。 通过ITR的重组、mRNA剪接和Cre-loxP消除ITR的对转录的抑制作用 ， 实现目的蛋白的表达 。 相比于单个载体维真生物提供的依赖Cre的反式剪接系统的表达效率约20% 。
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图7. 维真生物提供依赖Cre的反式剪接系统示意图（左）维真生物的依赖Cre的反式剪接系统实验图（右）
【诱导|知识分享：Cre-loxP重组系统】
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